Espectroscopía Raman y RMN para aplicaciones bioframacéuticas y farmacéuticas
Actualizado: 29 may 2020
Prof. Roberto Ebensperger
La producción de ingredientes farmacéuticos activos (API) está experimentando actualmente su mayor transformación en un siglo. Los cambios se basan en la introducción rápida y dramática de fármacos basados en proteínas y macromoléculas (conocidos colectivamente como biofarmacéuticos). Los productos biofarmacéuticos (o biológicos) se fabrican utilizando sistemas de expresión biológica (mamíferos, bacterias, células de insectos, etc.) y han generado una gran y una creciente industria biofarmacéutica o BioPharma (ventas anuales en Europa > Euro$35 mil millones). La complejidad estructural y química de los productos biológicos, combinada con la complejidad de la fabricación basada en células, impone una enorme carga analítica para caracterizar y cuantificar correctamente tanto los procesos (upstream processing) como los productos (downstream processing).
Cuando se identifican y cuantifican simultáneamente múltiples nutrientes de moléculas pequeñas del medio de cultivo, el procedimiento se vuelve metódicamente idéntico al conocido campo de la metabolómica. Tradicionalmente, los estudios metabolómicos se realizan mediante LC-MS, RMN o una combinación de las dos técnicas, según el número de muestra y la información deseada. Hoy en día, en un entorno industrial, se utilizan ampliamente técnicas de alto rendimiento (high-throughput) en lugar de ajustar los parámetros uno por uno de un procedimiento de fermentación a otro para facilitar la optimización de los parámetros de producción de proteínas.
La espectroscopía Raman (Figura 1) es una espectroscopia vibracional con una serie de propiedades útiles (no destructivas, sin contacto, de alta especificidad molecular y robustez) que la hacen particularmente adecuada para aplicaciones que generen tecnologías analíticas de procesos (PAT) en las que se requiere información molecular (composición y varianza). Asimismo, la RMN para estas aplicaciones, tienen varias ventajas sobre la LC-MS. En particular, estas aplicaciones de RMN requieren una manipulación mínima de la muestra, tienen una alta reproducibilidad y permiten la adquisición de alto rendimiento (high-throughput) de datos, y las técnicas de análisis de datos estadísticos que las acompañan están bien consolidadas.
Figura 1. Espectroscopía Raman. Principio de dispersión de la luz (light scattering) en el que se basa la espectroscopía Raman (A) y espectros Raman esquemáticos de algunas biomoléculas (B) y de muestras biológicas complejas como suero sanguíneo y un tejido (C). [Los espectros Raman de tejidos se obtienen desde cortes histológicos].
Los medios de cultivo celular utilizados en los procesos biofarmacéuticos deben proporcionar a las células nutrientes y energía, y deben mantener las condiciones dentro del biorreactor (p. ej., pH, osmolalidad, etc.) para generar un rendimiento óptimo de la proteína del producto. Como resultado, los medios de cultivo celular generalmente comprenden mezclas químicas complejas de sales inorgánicas, azúcares, aminoácidos, vitaminas, factores de crecimiento y tampones. La composición exacta de un medio de cultivo específico varía significativamente según el fabricante, su función y la línea celular a la que está dirigida (p. ej., un medio nutriente basal (basal nutrient medium) para una línea celular diferirá en composición del medio de alimentación (feed medium) para eso, o para cualquier otra línea celular). Además, algunos bioprocesos también requieren la adición de aditivos derivados biológicos complejos, como el suero fetal bovino (FBS), proteínas (p. ej., BSA) o hidrolizados (p. ej., soja o levadura).
Formulaciones de proteínas y pruebas de identidad.
La caracterización de estas mezclas complejas, que contienen nutrientes esenciales y vitaminas en una proporción bien definida, es un desafío porque los proveedores generalmente consideran sus composiciones como conocimiento patentado.
Los productos biológicos en su forma final a menudo se producen como soluciones concentradas o polvos liofilizados, y estos son muy buenos tipos de muestra para la espectroscopía Raman (composiciones relativamente simples y altas concentraciones).
Los espectros 1D 1H NMR proporcionan información cuantitativa y cualitativa similar a una huella dactilar sobre casi todos los componentes orgánicos y pueden demostrar la identidad de lote a lote de los medios comprados de manera robusta, rápida y de manera conveniente, que requiere una preparación de muestra mucho más simple que con otros métodos como HPLC-MS.
Al igual que con el análisis de formulación de API de molécula pequeña, los objetivos clave en esta situación son: monitoreo de procesos, mediciones de concentraciones de ingrediente biológico activo y excipientes, uniformidad de contenido, análisis de impurezas/contaminantes y formulación y estabilidad del fármaco. Todo esto se puede lograr, hasta cierto punto, con la espectroscopía Raman (Figura 2).
Figura 2. Procesos biofarmacéuticos en que se puede aplicar la espectroscopía Raman para el control de proceso.
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