El destino de las células madre adiposas después de la lipotransferencia asistida por células

Prof. Roberto Ebensperger

Los rellenos sostenibles son de suma importancia en la cirugía reconstructiva. La grasa autóloga se considera ideal para el aumento de tejidos blandos porque es biocompatible, versátil, de aspecto natural, no inmunogénica, económica y fácilmente obtenible, con baja morbilidad del sitio donante y los bajos gastos asociados con su procedimiento.

Las distintas tecnologías de injerto de grasa se utilizan popularmente en cirugía plástica y reconstructiva. Sin embargo, quedan muchas preguntas sin respuesta sobre el uso de injertos de grasa. En su mayoría, los datos disponibles sobre el injerto de grasa autólogo en la cirugía estética consisten solo de informes de casos, estudios de casos y revisiones retrospectivas.

Como ya se ha discutido, la viabilidad celular se considera como un factor importante que afecta la supervivencia y regeneración a largo plazo del tejido adiposo injertado. En relación con la supervivencia de injertos de grasa algunas preguntas se pueden plantear, como por ejemplo:

• ¿Cómo podemos predecir la tasa de supervivencia de los injertos de grasa?

• ¿La elección del área donante afecta la supervivencia del injerto?

• ¿Qué técnica se debe utilizar para cosechar el injerto?

• ¿Cómo debe prepararse el injerto para lograr la máxima supervivencia del injerto?

• ¿Cuál es la mejor técnica de inyección?

• ¿Las células madre adiposas contribuyen a la supervivencia del injerto?

• ¿cuántas ADSC son necesarias para mejorar la supervivencia del injerto?

• ¿nuevas tecnologías basadas en vesículas extracelulares reemplazarán a las ADSC en el procedimiento de lipotransferencia asistida por células o CAL?

Pues bien, ahora intentaremos en la respuesta a dos de estas preguntas a través del análisis de elegantes abordajes experimentales que han contribuido a despejar algunas de estas interrogantes.

¿Es suficiente la fracción vascular estromal (SVF) para los procedimientos de lipotransferencia asistida por células (Cell-assisted lipotransfer, CAL)?

Los estudios en animales han demostrado que los injertos de grasa enriquecidos con ADSC expandidas ex-vivo mejoraron notablemente el volumen residual del injerto y la apariencia histológica. Sin embargo, se debía aclarar si el enriquecimiento de injertos de grasa con ADSC en humanos podría mejorar la supervivencia del injerto y, por lo tanto, hacer que los procedimientos de lipofilling sean una alternativa atractiva al aumento de tejido con material artificial y/o alogénico o cirugía mayor de colgajo de tejido. Sabemos que los reportes informan tasas de reabsorción que alcanzan el 80% (incluso más).

El siguiente estudio de cirujanos daneses contribuye a clarificar este punto y orientarnos hacia el mejoramiento de las tecnologías y procedimientos de injertos de grasa autóloga para mejorar su eficacia de retención de volumen del implante. Se trata del trabajo “Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial”, publicado el 2013 en The Lancet.

En este estudio, se usa una inyección en bolo para i) reflejar las características clínicas del lipofilling a gran escala, como en la reconstrucción mamaria después de la mastectomía, donde el lecho receptor tiene muy poco tejido bien vascularizado en el que colocar un gran injerto; ii) para determinar fácilmente si las ADSC añadidas tuvieron algún efecto en un entorno en el que se sabe que los injertos de grasa no manipulados tienen una supervivencia muy pobre; y iii) para mejorar la facilidad de extracción de injertos de grasa al final del estudio para una evaluación histológica adecuada y iv) porque los participantes estaban sanos sin necesidad de inyecciones de lipoinyección.

En este estudio, los participantes sanos se sometieron a dos liposucciones tomadas con 14 días de diferencia: una para el aislamiento de ADSC y su expansión ex vivo, y otra para la preparación de injertos de grasa. Se prepararon dos injertos de grasa purificada (30 ml cada uno) tomados de la segunda liposucción para cada participante. Un injerto se enriqueció con ADSC (20 millones células por ml de grasa) y otro injerto sin enriquecimiento con ADSC sirvió como control. Los injertos de grasa se inyectaron por vía subcutánea en forma de bolo en la parte posterior del brazo superior derecho e izquierdo de acuerdo con la secuencia de aleatorización. Los volúmenes de injertos de grasa inyectados se midieron por MRI inmediatamente después de la inyección y después de 121 días antes de la extracción quirúrgica. El objetivo principal fue comparar los volúmenes de injerto residual de los injertos enriquecidos con ASC con los de los injertos de control.

El procedimiento tuvo una excelente viabilidad y seguridad y se informa sobre un efecto notoriamente significativo y sustancial de las células madre agregadas en el injerto de grasa enriquecido con ADSC (figura 1).

Estos resultados prometedores aumentan significativamente la posibilidad de uso de células madre en entornos clínicos y muestran que el enriquecimiento de injertos con ADSC podría hacer que el lipofilling sea un procedimiento confiable, ya que se puede predecir la tasa de reabsorción, la calidad del tejido y la seguridad. Este procedimiento podría resultar ser una alternativa viable a los principales aumentos de tejido, como el aumento de senos, con material alogénico o cirugía mayor de colgajo de tejido con menos efectos secundarios, mejor seguridad y resultados cosméticos más satisfactorios. Estas terapias podrían revolucionar la reconstrucción mamaria después del cáncer y la reconstrucción de deformidades después de un trauma, por ejemplo.

Figura 1. Resultados del enriquecimiento de un injerto de grasa autólogo con ADSC.

Izquierda. imágenes de Resonancia Magnética (MRI) y delineación de los injertos implantados. Imágenes basales de MRI de las áreas objetivo antes de la implantación de (A) un injerto enriquecido con ADSC y (B) un injerto de control. (C, D) Imágenes de MRI post-implantación del área objetivo con delineación del injerto. (E, F) Las mismas áreas el día 121 antes de la extracción del injerto. Las imágenes insertadas muestran las áreas de injerto sin delineación, como referencia.

Derecha. Volúmenes de trasplante. (A) Volúmenes de trasplantes en injertos enriquecidos con ADSC e injertos de control en el día 0 y el día 121. Las gráficas muestran las medias con IC del 95%. (B) Gráfico de espagueti de las fracciones de volumen de trasplante residual en injertos enriquecidos con ADSC e injertos de control. Se destacan los volúmenes residuales medios con IC del 95%. [Source: Trojahn Kølle S-F, et al. Lancet (2013) 382: 1113–1120]

¿Cuál es el destino de las células madre derivadas de tejido adiposo después de la lipotransferencia asistida por células

La lipotransferencia asistida por células es un proceso en el cual el injerto de grasa se complementa o enriquece con células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADSC) autólogo. Desde que se demostró la eficacia de la técnica, los estudios se han centrado en el mecanismo por el cual la suplementación con células (ADSC) mejora la tasa de supervivencia del injerto.

Actualmente, se han sugerido algunos mecanismos asociados con la mejora de la supervivencia de los injertos de grasa mediada por ADSC. Primero, las ADSC promueven la angiogénesis y la posterior revascularización del tejido receptor circundante mediante la secreción y acción paracrina de varios factores de crecimiento. La revascularización oportuna puede minimizar los inevitables cambios degenerativos inducidos por la isquemia severa y la hipoxia. Segundo, ADSC pueden impulsar la angiogénesis y la adipogénesis mediante su diferenciación directa en células endoteliales y adipocitos. [Revisar El relleno dérmico ideal, en esta misma sección]

En el siguiente trabajo que les voy a presentar, Hong y colaboradores, en "The Fate of the Adipose-Derived Stromal Cells during Angiogenesis and Adipogenesis after Cell-Assisted Lipotransferen", en 2018, a través de un abordaje experimental muy elegante han contribuido a dar respuesta a esta interrogante.

Los autores introdujeron un modelo animal de lipotransferencia asistida por células utilizando dos ratones transgénicos reporteros diferentes. Grasa donante procedente de ratones C57BL/6J que expresan proteína fluorescente verde (GFP) y ADSC de ratones C57BL/6J que expresan DsRed (proteína fluorescente roja) se co-transplantaron en ratones receptores C57BL/6J nativos o wild type.

En el grupo control, se injertó grasa de animales de proteína fluorescente verde sin suplementos de células ADSC DsRed. La grasa se inyectó en el plano supraperióstico del cráneo con una aguja de calibre 16 acercándose desde el cuello posterior por medio de una 'tunelización' subcutánea para minimizar la filtración o fuga del injerto (figura 2). Basados en referencias, en este modelo animal de CAL, se decidió que la cantidad de ADSC de DsRed (proteína fluorescente roja) sea 1.0 x 10^6/mL grasa (grupo de ADSC bajo) y 4.0 x 10^6/mL grasa ADSC (grupo de ADSC alto). Curiosamente, la adición de un mayor número de células de la fracción vascular estromal (SVF) impacta negativamente sobre la retención del injerto de grasa. El volumen del injerto se midió mediante tomografías computarizadas.

Durante la remodelación adiposa después de la lipotransferencia asistida por células, el destino de cada adipocito donante (verde) y célula ADSC derivada de tejido adiposo donante (roja) se rastreó usando microscopía e inmunofluorescencia.

Figura 2. Modelo animal de lipotransferencia asistida por células.

(Izquierda) La grasa del donante de los ratones BL6 con proteína fluorescente verde y las células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADSC) de los ratones BL6 DsRed con proteína fluorescente roja se co-transplantaron al plano supraperióstico del cráneo de los ratones BL6 wild type (n = 8 por grupo). (Derecha) El sitio del receptor en la cabeza (flecha) sobresalió después del injerto de grasa. El volumen del injerto se determinó mediante escaneos de microtomografía computarizada (microCT). GFP, proteína verde fluorescente. BL6: ratones C57BL/6J. [Source: Hong KY, et al. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365]

La suplementación con ADSC alteró la inflamación y promovió la angiogénesis y la posterior revascularización en el tejido receptor. El rastreo en la semana 4 postoperatoria reveló que las ADSC sobrevivientes participaron en la angiogénesis al diferenciarse en células endoteliales. Además, la grasa nueva y recién diferenciada de las ADSC del donante y el tejido receptor se integraron con la grasa sobreviviente del donante, lo que condujo a una mejor retención del injerto. La suplementación con ADSC resultó en una diferencia cuantitativa en la angiogénesis y la adipogénesis durante la remodelación adiposa de acuerdo con la concentración ADSC [Figuras 3, 4, 5 Y 6].

Figura 3. Angiogénesis durante la remodelación del tejido adiposo después de la lipotransferencia asistida por células.

El número promedio de vasos en el grupo de ADSC alto fue significativamente mayor que en los grupos control y ADSC bajo en la semana 4 postoperatoria (Izquierda). Los vasos GFP+CD31+ (flechas) de grasa de GFP que sobrevive y los vasos GFP-DsRed-CD31+ (puntas de flecha) de los BL6 receptores se integraron en el injerto (Centro). Se observaron vasos de DsRed+CD31+ (puntas de flecha) originados a partir de ASCs DsRed en

el injerto (Derecha). * p <0.05 versus grupo control. Barras de escala = 100 μm. BL6: ratones C57BL/6J. [Source: Hong KY, et al. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365]

Figura 4. Adipogénesis durante la remodelación del tejido adiposo después de la lipotransferencia asistida por células.

Tres tipos de adipocitos, incluyendo adipocitos GFP+ perilipina+ (flechas blancas) de la grasa GFP que sobrevive, adipocitos DsRed+ perilipina+ (cabeza de flecha) diferenciados de las ADSC DsRed y adipocitos GFP-DsRed- perilipin+ del receptor (flechas) integrado en agrupaciones de tejido adiposo único dentro de los injertos del grupo de ADSC alto. Barras de escala = 50 μm. [Source: Hong KY, et al. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365]

Figura 5. Análisis cuantitativo de la angiogénesis y la adipogénesis después de la lipotransferencia asistida por células según la concentración de células mesenquimales derivadas de tejido adiposo DsRed (ADSC).

(Arriba) Las imágenes de grasa de GFP mezclada con ADSCs DsRed en los grupos de ADSC bajo (izquierda) y alto (derecha) en la semana 4 postoperatoria. (Abajo, a la izquierda) En la superficie del injerto, sobrevivieron las ADSC de DsRed en el grupo de ADSC alto que mostraron una mayor tasa de diferenciación (DsRed+/DsRed+ diferenciado) que las del grupo con ADSC bajo. El grupo con ADSC alto mostró una mayor densidad de angiogénesis (DsRed+ CD31+/CD31+) (abajo, centro) y adipogénesis (DsRed+ perilipin+/perilipin+) (abajo, derecha) por diferenciación de DsRed ADSC que el grupo ADSC bajo. * p <0.05 versus grupo de ASC bajo. Barras de escala = 100 μm. [Source: Hong KY, et al. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365]

Figura 6. Esquema que resume los resultados obtenidos en este trabajao y que describe el destino de los principales componentes celulares en la lipotransferencia asistida por células.

Después del injerto, la grasa GFP del donante y las ADSC DsRed experimentan cambios degenerativos asociados con la hipoxia y la isquemia. Varios factores de crecimiento, que se presume son secretados por las ADSC del donante, promueven el crecimiento vascular del receptor. Las ADSC de los donantes participan en la formación de nuevos vasos al diferenciarse en células endoteliales y aceleran la revascularización entre el tejido del donante y el receptor. La grasa nueva y producto de la diferenciación de las ADSC del donante junto con la grasa sobreviviente del donante se integran con el tejido receptor, lo

que resulta en una mejor retención del injerto. [Source: Hong KY, et al. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365]

Trojahn Kølle S-F, et al. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet (2013) 382: 1113–1120

Hong KY, et al. The Fate of the Adipose-Derived Stromal Cells during Angiogenesis and Adipogenesis after Cell-Assisted Lipotransfer. Plast Reconstr Surg. (2018) 141: 365