Vesículas Extracelulares. ¿La próxima generación de medicamentos?

Prof. Roberto Ebensperger (Junio 2020)

"El exosoma, la estrella en ascenso en la entrega de fármacos"

Los exosomas pueden administrar terapias en las células que de otro modo serían difíciles de lograr. Las compañías esperan usar estas vesículas para empacar fármacos de moléculas pequeñas, proteínas y ARN o incluso usar las mismas vesículas como terapias.

Se denominan vesículas extracelulares a un conjunto heterogéneo de estructuras membranosas liberadas por las células. Las principales vesículas extracelulares son los exosomas, las microvesículas y los cuerpos apoptóticos (figura 1).

Estos tres tipos de vesículas extracelulares varían en tamaño, contenido y mecanismo de formación. Hasta la fecha, los exosomas y las microvesículas generadas a partir de células sanas se han caracterizado más ampliamente y la formación de estas vesículas extracelulares es clave para mediar la comunicación intercelular y la regulación de la respuesta inmune. Se ha demostrado que los exosomas y las microvesículas desempeñan un papel importante en procesos que incluyen la presentación de antígenos, la supresión inmune, la inmunidad antitumoral y la autoinmunidad. Ahora bien, varios estudios han sugerido que los cuerpos apoptóticos tienen una importancia funcional similar a las vesículas extracelulares liberados por las células sanas. La formación de cuerpos apoptóticos tiene dos funciones clave propuestas: (a) ayudar a la eliminación de células apoptóticas y (b) funcionar como medios de comunicación intercelular, los cuales tienen también implicancias en la regulación inmune.

La apoptosis es un proceso altamente regulado de muerte celular. A diferencia de la necrosis, que es una versión traumática de la muerte celular, la apoptosis es una decisión racional y activa tomada para sacrificar células específicas para obtener los mayores beneficios del organismo. Es un proceso fisiológico normal que se realiza rutinariamente en organismos multicelulares. Los cuerpos apoptóticos [1] son una vesícula que contiene partes de una célula moribunda y se pueden formar durante la fase de ejecución del proceso apoptótico, cuando el citoesqueleto de la célula se rompe y hace que la membrana sobresalga. Estas protuberancias pueden separarse de la célula, llevándose consigo una porción de citoplasma, para convertirse en cuerpos apoptóticos. Estos son luego engullidos por las células fagocíticas, y sus componentes reciclados. Los cuerpos apoptóticos pueden variar en tamaño de 0.8 a 5um.

Las microvesículas [2] son sacos heterogéneos unidos a la membrana que se desprenden de la superficie de las células hacia el entorno extracelular en un proceso altamente regulado (un proceso también llamado ectocitosis). Se desprenden después de la incorporación selectiva de una gran cantidad de carga molecular que incluye múltiples moléculas bioactivas, proteínas, ARNm y miARN. Las microvesíclas pueden servir como vehículos extracelulares para transportar moléculas bioactivas desde sus células parentales a las células receptoras objetivo, sirviendo así, como nuevos mediadores para la comunicación intercelular.

La identificación de microvesículas en múltiples fluidos corporales ha aumentado el interés en la investigación destinada a dilucidar sus funciones en tejidos sanos y enfermos, proporcionando una nueva visión de la etiología de las enfermedades humanas complejas, por lo que las microvesículas también muestran una gran promesa como una herramienta para el diagnóstico avanzado. y terapia a medida que avanzamos hacia una nueva era de medicina personalizada. Las microvesículas pueden ser tan pequeñas como las vesículas extracelulares más pequeños (50 nm de diámetro) o tan grandes como 1000 nm (1 mm).

Figura 1. Funciones biológicas y fisiológicas de las vesículas extracelulares (VE) en los fluidos corporales y su impacto en el equilibrio de la salud y la enfermedad.

Los exosomas [3] son nanovesículas constituidas por una bicapa lipídica, con un diámetro entre 30 y 150 nm. Estas vesículas extracelulares tienen origen endocítico y se componen de diferentes biomoléculas como proteínas, lípidos, ADN, ARNm, miRNA y ARN no codificante largo (lncRNA), variando su contenido dependiendo de las condiciones y del tipo de célula de origen. Una vez formados, los exosomas, se liberan al espacio extracelular, donde llevarán a cabo su función. Estas vesículas están implicadas en la comunicación célula- célula transmitiendo la información principalmente de tres formas: interacción ligando-receptor, fusión con la membrana citoplasmática y fagocitosis. Actualmente, tienen un papel relevante en el cáncer, ya que transfieren proteínas oncogénicas y ácidos nucleicos a las células receptoras modulando su actividad, cobrando gran relevancia en los procesos de tumorigénesis, metástasis, crecimiento celular y resistencia a los medicamentos (figura 2).

Figura 2. Biología de exosomas. Arriba, variedad de moléculas biológicas usualmente presentes en la composición de los exosomas. Abajo, esquema de la biogénesis del exosoma. Los exosomas surgen de la fusión de invaginaciones de la membrana superficial (cuerpos multivesiculares) y los productos del aparato de Golgi. Las vesículas resultantes se degradan por lisosomas o se secretan como exosomas. lncRNA = RNA largo no codificante; miRNA = microRNA; mRNA = ARN mensajero.

Los exosomas se pueden aislar de diversos fluidos corporales, incluida la leche materna, la saliva, el suero, el plasma, el líquido amniótico, el líquido ascítico y la orina. Las células secretan exosomas tanto en condiciones normales como patológicas transportando diversos ácidos nucleicos y proteínas que proporcionan información sobre los estados fisiopatológicos (de salud) de las células donantes, y por lo tanto, se considera que tienen un gran potencial para contener biomarcadores valiosos para el diagnóstico clínico. Además, los exosomas que se liberan naturalmente de ciertos tipos de células muestran un interesante potencial para ser utilizados como herramientas terapéuticas en terapia regenerativa libre de células (cell-free therapy). Por ejemplo, los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC) reproducen las actividades inmunomoduladoras, citoprotectoras y regenerativas de sus células progenitoras. Finalmente, los exosomas tienen un gran potencial para ser sistemas de administración específicos de fármacos debido a sus propiedades naturales de transporte de material, su capacidad intrínseca circulatoria de largo plazo y buena biocompatibilidad, que son adecuados para administrar una gran variedad de sustancias químicas, proteínas, ácidos nucleicos y agentes terapéuticos genéticos (figura 3) [4]. Sin embargo, todavía falta un método eficaz para cargar agentes proteicos específicos en los exosomas para su absorción por las células diana, por lo que el potencial de aplicación del exosoma todavía es limitado.

Figura 3. Exosomas naturales y producto de bioingeniería para fines terapéuticos. Los exosomas naturales de las células madre han demostrado los efectos protectores sobre la supervivencia y la proliferación de células como los cardiomiocitos. Las células modificadas con carga exógena, incluidos los siRNA, miRNANy shRNA, secretan exosomas que contienen estos siRNA, miRNA o shRNA. Estas mismas células, mediante transfección con plásmidos, se pueden modificar para que expresen péptidos diana que producirán exosomas que pueden dirigirse a poblaciones celulares específicas. Alternativamente, la carga exógena (fármaco) se puede cargar directamente en los exosomas por electroporación, lipofección, sonicación o Ca2+. Las células receptoras pueden tomar los exosomas cargados con carga endógena y/o exógena para la regulación de la expresión génica o ejercer el efecto farmacológico buscado.

"Las vesículas extracelulares (EV) se han convertido en un tema candente entre los investigadores, los profesionales médicos y la industria biofarmacéutica."

Los exosomas han atraído mucha atención en los últimos años, y el número de artículos publicados aumentó exponencialmente durante la última década (+3000 solo en 2019) (Figura 4), debido en parte a su emocionante y enorme potencial para encapsular, proteger y entregar específicamente una gran variedad de cargas de macromoléculas biológicamente activas [5].

Figura 4. Publicaciones sobre exosomas a lo largo del tiempo.

La investigación sobre el mecanismo de acción para las terapias con células madre ha demostrado que los factores paracrinos secretados (incluidas las VE) son los elementos regenerativos esenciales [6], y señala los beneficios potenciales del uso de VE disponibles en el mercado a partir de células madre alogénicas adultas (y otras fuentes) para tratar una amplia gama de afecciones, incluidas las respiratorias (EPOC) [7] y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) relacionado con COVID-19 [Ver Proyecto R. Ebensperger – “Desarrollo de una Solución para Nebulización como Tratamiento del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SRAS) por COVID-19 basada en el Secretoma de Células Mesenquimales”]

Los exosomas representan una clase completamente nueva de vehículos de entrega de compuestos que tienen el potencial de revolucionar la entrega de medicamentos al permitir la orientación a tipos de células y tejidos específicos, es decir, Targeted Drug Delivery Systems, superando potencialmente problemas de potencia, inmunogenicidad y toxicidad que han obstaculizado muchos esfuerzos para abordar objetivos y otras estrategias prometedoras. [Ver artículo “Administración dirigida de fármacos (targeted drug delivery)” y proyecto “Administración dirigida de fármacos (targeted drug delivery) mediante liposomas funcionalizados” y "Microvesículas de leche bovina para recubrimiento luminal terapéutico del intestino"]

Hasta ahora, la promesa de las VE como medicamentos de próxima generación libres de células se ha visto limitada por 'problemas de fabricación', vale decir, la capacidad de purificar las VE a gran escala como un producto de tipo biológico patentado y bien definido.

El progreso de las VE nativas (hVEN) de las células madre humanas (MSC) como medicamentos tiene dos influencias positivas:

1. Las VE son factores endógenos y de origen natural en nuestros cuerpos, es decir, es probable que sean seguros y funcionen;

2. Las MSC alogénicas se han utilizado en cientos de ensayos clínicos [8] y las VE son una parte clave del mecanismo de acción (MOA) de las MSC [9], es decir, es probable que las hVEN sean seguras si se fabrican adecuadamente.

Para las empresas de biotecnología, un proceso propietario es importante, potencialmente esencial. Las compañías de biotecnología que usan el secretoma de células madre adultas 'tipo estándar' (por ejemplo, MSC) necesitan un paso patentado en su proceso de purificación para tener un producto propietario (el producto es el proceso - el proceso es el producto) y con ello los derechos de propiedad intelectual.

En diciembre de 2019, la revista Nature Biotechnology publicó un artículo [10] en el que se enumeran 14 empresas que están desarrollando productos de medicina basados en VE. Pero en abril de 2020, Exopharm parece ser el único que ha comenzado la administración humana en su estudio PLEXOVAL I de seguridad y eficacia en curación de heridas.

Actualmente, se están tomando dos enfoques distintos para desarrollar la terapéutica basada en exosomas [4,11]:

1. utilizar exosomas naturales de células productoras (generalmente derivadas de células madre mesenquimales, MSC); o

2. usar ingeniería de exosomas para dotarlos con propiedades específicas similares a los fármacos.

Si bien ambos enfoques tienen mérito, el uso de exosomas derivados de células madre requiere menos tiempo y esfuerzo para llevar a cabo experimentos con la calidad de investigación, pero la creación y el uso de exosomas diseñados racional e intencionalmente con propiedades altamente definibles y reproducibles y un mecanismo conocido de acción (MOA) es tanto una alternativa convincente para trabajar con ellos en lugar de con exosomas altamente heterogéneos derivados naturalmente, con MOA mal definidos como una base más sólida y viable para el avance de nuevos medicamentos avanzados.

Si bien hay mucho interés en llevar la tecnología basada en los exosomas a la clínica, el progreso en el campo se ha visto limitado por dos desafíos principales:

1. Ingeniería segura y confiable de exosomas para crear propiedades definidas similares a los fármacos;

2. Fabricación GMP de exosomas de manera reproducible y a una escala suficiente.

El campo de los exosomas ahora ha avanzado y creo que el progreso en la ingeniería de exosomas y la fabricación industrial a gran escala ha permitido el desarrollo clínico de terapias basadas en exosomas [12].

Exosomas y leche

El consumo de leche bovina generalmente se considera seguro y aporta importantes beneficios nutricionales. Inspirados por este fenómeno natural, una gran cantidad de estudios han comenzado a desarrollar formulaciones orales utilizando VE de leche como envolturas de agentes quimioterapéuticos protegiéndolos del bajo pH gástrico y de las enzimas digestivas en el estómago [13].

En 2014, Melnik y col. [14] sugirieron que los exosomas de leche bovina proporcionan una alternativa viable con alto impacto debido a la rentabilidad, la biocompatibilidad, la estabilidad, la capacidad del dirigirse al tumor y la falta de toxicidad. Munagala y col. (2016) informaron que la leche cruda de bovino madura puede servir como una fuente biocompatible y rentable para cosechar cantidades masivas de exosomas y que los exosomas de leche tienen un tremendo potencial como portadores de fármacos para agentes hidrofílicos y lipofílicos, incluidos los fármacos de quimioterapia. También se sugiere que los exosomas derivados de la leche son un nanoportador natural viable para la administración de siRNA en la aplicación terapéutica contra el cáncer [15].

Es interesante desarrollar VE de leche para la administración de nuevos medicamentos debido a los méritos de la rentabilidad, la biocompatibilidad, la estabilidad física y biológica, la escalabilidad del proceso de fabricación, la versatilidad de los agentes que puede transportar y la capacidad de funcionalizarse con ligandos para dirigirlos selectivamente [13] [Ver proyecto "Microvesículas de leche bovina para recubrimiento luminal terapéutico del intestino" .

Tablas suplementarias

Funciones y ventajas de la medicina EV

Muchas formas de medicamentos basados en VE

Perfiles de riesgo generales de los distintos tipos de medicamentos basados en VE

Limitaciones de algunas técnicas de purificación de VE

[1] Caruso S and Poon IKH. Apoptotic Cell-Derived Extracellular Vesicles: More Than Just Debris. Front Immunol (2018) 9:1486

[2] Tricarico C et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. SMALL GTPASES (2017) 8(4): 220–232

[3] Casado-Díaz A, et al. Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells (MSC) in Regenerative Medicine: Applications in Skin Wound Healing. (2020) Front Bioeng Biotechnol 8:146

[4] Li S et al. Exosomal cargo-loading and synthetic exosomemimics as potential therapeutic tools. Acta Pharmacologica Sinica (2018) 39: 542–551

[5] Agrahari V et al. Extracellular Microvesicles as New Industrial Therapeutic Frontiers. Trends in Biotechnology (2019) 37(7): 707-729

[6] Caplan AI. Mesenchymal Stem Cells: Time to Change the Name! Stem Cells Transl Med (2017) 6(6): 1445–51

[7] Hannah E et al. Extracellular vesicles in chronic obstructive pulmonary disease (COPD). J Thorac Dis (2019) 11(Suppl 17): S2141-S2154

[8] Kabat M, et al. Trends in mesenchymal stem cell clinical trials 2004-2018: Is efficacy optimal in a narrow dose range? Stem Cells Transl Med (2020) 9(1): 17–27

[9] Zhang ZG, et al. Exosomes - beyond stem cells for restorative therapy in stroke and neurological injury. Nat Rev Neurol (2019) 15(4): 193–203

[10] Zipkin M. Exosome redux. Nat Biotechnol2019; 37(12): 1395–400

[11] Meng W et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Delivery (2020) 27(1): 585–598

[12] Wiklander OPB et al. Advances in therapeutic applications of extracellular vesicles. Sci Transl Med (2019) 11: eaav8521

[13] Munagala R et al. Bovine milk-derived exosomes for drug delivery. Cancer Lett (2016) 371:48–61

[14] Melnik BC et al. Milk: an exosomal microRNA transmitter promoting thymic regulatory T cell maturation preventing the development of atopy? J Transl Med (2014) 12:43

[15] Aqil F et al. Milk exosomes – natural nanoparticles for siRNA delivery. Cancer Lett (2019) 449:186–95

Exosomas - La próxima generación de medicamentos